液相色谱仪（HPLC）的全流程操作涉及多个关键步骤，需严格遵循规范以确保数据准确性和仪器稳定性。以下是详细的操作要点及注意事项：

一、前期准备

流动相配制

使用高纯度溶剂（HPLC级）和超纯水（电阻率≥18.2 MΩ·cm）。

有机相需过滤（0.22 μm滤膜）并超声脱气（15-20分钟），水相建议现配现用。

缓冲盐流动相需注意pH稳定性，避免微生物滋生（可添加0.1%叠氮化钠）。

样品处理

样品需完全溶解，避免堵塞色谱柱，必要时离心（12000 rpm, 5分钟）或过滤（0.22 μm滤膜）。

复杂基质样品建议固相萃取（SPE）或蛋白沉淀等前处理。

色谱柱选择与平衡

根据分析物性质选择反相（C18）、正相（硅胶柱）或离子交换柱。

新柱需用流动相低流速（0.2-0.5 mL/min）平衡30分钟以上，柱温箱温度设定需与实验条件一致。

二、仪器操作流程

开机与系统准备

开启电源，依次启动泵、自动进样器、柱温箱、检测器（如UV、DAD、MS）。

用起始流动相冲洗系统，排除气泡（可设置高流速1-2 mL/min冲洗5分钟）。

方法设置

泵参数：流速（常为0.8-1.5 mL/min）、梯度程序（需平衡时间足够）。

检测器参数：UV波长（根据化合物最大吸收峰）、DAD扫描范围、MS离子源参数（ESI/APCI）。

柱温：通常25-40℃，高温分析需确认色谱柱耐受性。

基线平衡

观察基线漂移和噪声，UV基线漂移应＜0.5 mAU/30分钟。

进样分析

用标准品验证系统适用性（如理论塔板数、分离度、拖尾因子）。

自动进样器需清洗进样针（3次以上），避免交叉污染。

数据采集与监控

实时监测压力波动（正常波动范围±10%），异常升高可能提示堵塞。

三、维护与关机

色谱柱冲洗

反相柱：先用高水相冲洗，再过渡到纯有机相保存（如甲醇或乙腈）。

缓冲盐流动相：必须先用5-10%甲醇水溶液冲洗30分钟，避免盐析出。

系统冲洗

切换至纯水（10分钟）→纯有机相（20分钟），避免盐或样品残留。

关机顺序

先停检测器，再停泵，最后关闭工作站软件和电源。

四、常见问题与解决

压力异常高：检查滤头（在线过滤器）、保护柱或色谱柱堵塞，逐步拆卸排查。

峰形拖尾：可能因色谱柱老化或样品溶剂与流动相不兼容，尝试调整流动相pH或更换色谱柱。

基线噪声大：检查流动相纯度、检测器灯能量或氘灯寿命。

五、注意事项

安全操作：有机溶剂需在通风橱中处理，废液分类收集。

记录完整性：记录色谱柱批号、流动相比例、压力变化等关键参数。

定期维护：每月检查泵密封圈、单向阀，每半年更换氘灯（UV检测器）。

通过规范操作和定期维护，可显著延长仪器寿命并保证数据可靠性。复杂样品或新方法开发时，建议进行预实验优化条件（如梯度程序、柱温等）。