液相色谱仪（HPLC）的完整操作流程包括准备、开机、方法设置、样品分析、数据处理和关机维护等步骤。以下是详细操作流程：

一、前期准备

流动相准备

使用高纯度溶剂（HPLC级或更高），过滤（0.45 μm或0.22 μm滤膜）并脱气（超声、抽真空或在线脱气）。

标注流动相组成、比例及制备日期。

对缓冲盐流动相需注意pH值调节和过滤。

样品准备

样品溶解于与流动相兼容的溶剂中，避免堵塞色谱柱。

过滤（0.22 μm滤膜）或离心去除颗粒物。

色谱柱选择

根据分析物性质选择反相（C18）、正相、离子交换等色谱柱。

检查色谱柱保存液是否与流动相匹配，必要时平衡。

二、开机与系统平衡

开机顺序

打开电源，启动泵、自动进样器、柱温箱、检测器（如UV、DAD、荧光等）。

打开工作站软件，连接仪器。

系统冲洗与平衡

用低流速（如0.2 mL/min）逐步过渡到方法所需流动相（避免突然切换溶剂）。

平衡至基线稳定（压力、信号波动＜2%），通常需10-30分钟。

三、方法设置

色谱条件输入

泵参数：流速、流动相比例（等度/梯度）、压力上限。

柱温箱：设定温度（通常25-40℃）。

检测器：波长（UV）、采样频率、参比波长等。

进样器：进样体积（1-100 μL）、洗针程序。

方法验证

运行空白（流动相）检查基线噪音。

注入标准品确认保留时间、峰形和分离度。

四、样品分析

序列设置

在工作站中编辑样品序列（标样、待测样、QC样等），设置进样顺序和重复次数。

运行监控

实时观察压力、基线信号和峰形。

异常情况（压力突升、基线漂移）立即暂停排查。

五、数据处理与报告

积分与校准

手动或自动积分色谱峰，确保基线分离。

用标准曲线计算样品浓度（外标法/内标法）。

系统适用性测试（SST）

检查理论塔板数（N）、拖尾因子（T）、分离度（R）是否符合药典或标准要求。

报告导出

生成包含保留时间、峰面积、浓度的分析报告。

六、关机与维护

系统冲洗

反相柱：先用高水相（如90%水）冲洗，再过渡到有机相（如甲醇或乙腈）。

缓冲盐流动相：先用水冲洗30分钟以上，再用有机相替换。

关机顺序

关闭检测器、柱温箱、泵，最后关工作站和电源。

维护要点

色谱柱：保存在推荐溶剂中，密封避光。

泵密封垫：定期更换（如每3-6个月）。

记录：填写仪器使用日志，记录异常情况。

注意事项

压力异常：可能因堵塞（检查滤头、保护柱）或气泡（重新脱气）。

峰形问题：拖尾可能因柱效下降或pH不匹配；分叉可能因色谱柱污染。

法规合规：若用于GMP/GLP，需进行完整的IQ/OQ/PQ验证。

以上流程需根据具体仪器型号（如Agilent、Waters、Shimadzu等）和实验需求调整。首次操作建议在专业人员指导下进行。